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遗传发育所在作物基因组编辑育种技术方法研究中取得进展90934a.c

发布日期:2020-01-26 12:52   来源:未知   阅读:

  •   作为国家在科学技术方面的最高学术机构和全国自然科学与高新技术的综合研究与发展中心,建院以来,中国科学院时刻牢记使命,与科学共进,与祖国同行,以国家富强、人民幸福为己任,人才辈出,硕果累累,为我国科技进步、经济社会发展和国家安全做出了不可替代的重要贡献。/ 更多简介 +

      中国科学技术大学(简称“中科大”)于1958年由中国科学院创建于北京,1970年学校迁至安徽省合肥市。中科大坚持“全院办校、所系结合”的办学方针,是一所以前沿科学和高新技术为主、兼有特色管理与人文学科的研究型大学。

      中国科学院大学(简称“国科大”)始建于1978年,其前身为中国科学院研究生院,2012年更名为中国科学院大学。国科大实行“科教融合”的办学体制,与中国科学院直属研究机构在管理体制、师资队伍、培养体系、科研工作等方面共有、共治、共享、共赢,是一所以研究生教育为主的独具特色的研究型大学。

      上海科技大学(简称“上科大”),由上海市人民政府与中国科学院共同举办、共同建设,2013年经教育部正式批准。上科大秉持“服务国家发展战略,培养创新创业人才”的办学方针,实现科技与教育、科教与产业、科教与创业的融合,是一所小规模、高水平、国际化的研究型、创新型大学。

      遗传与变异是物种进化的基础。通过物理、化学方法(如辐射诱变、EMS诱变)产生全基因组的随机突变已经成为农作物育种的常规手段,但其中具有新型农艺性状突变体的筛选较为费时、费力。定向进化(Directed Evolution)则通过创制目标基因的突变文库,在施加一定选择压力下能够快速获得目的突变体。目前,植物基因的定向进化通常先通过易错PCR、DNA合成或DNA重组等方法在体外产生目标基因的突变文库,再转化到大肠杆菌或酵母中进行功能筛选。然而,由于离开原始的基因组和细胞环境,筛选出来的基因突变可能并不能完全反映出它在植物中的真实功能。更重要的是,大多数重要农艺性状无法在大肠杆菌或酵母中进行筛选。因此,建立一种在植物原位进行基因饱和突变和功能筛选的定向进化新方法将有助于加快植物育种及重要功能基因研究的进程。近日,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组和李家洋研究组合作,构建了新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器STEME,并在植物中实现了基因的定向进化和功能筛选。

      研究者将胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脱氨酶ecTadA-ecTadA7.10同时融合在nCas9 (D10A)的N端,并将抑制体内尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表达的形式置于nCas9 (D10A)的C端,共构建了4种形式的双碱基编辑器STEME(STEME-1至STEME-4)。STEME双碱基编辑器均可以只在一个sgRNA引导下就可以诱导靶位点CT和AG的同时突变,显著增加了靶基因碱基突变的饱和度及产生突变类型的多样性。STEME-1在水稻原生质体中CT诱导效率高达61.61%,CT和AG同时突变的效率也高达15.50%。为了提高靶基因的碱基覆盖度,研究者进一步利用能够识别NG PAM的变体Cas9-NG构建了第5个双碱基编辑器STEME-NG,发现只需要20个sgRNA就可以对OsACC上编码56个氨基酸的序列实现近饱和的突变。

      为了展示STEME在植物中的定向进化能力,研究者设计了靶向OsACC羧基转移酶结构域上400个氨基酸编码序列的200个独立的sgRNA,分别构建到STEME-1或STEME-NG双元载体上。将构建好的双元载体分为27个转化组,每个组内混合了等分子量的4至11个sgRNA载体,覆盖80-142 bp的靶DNA区域,便于提高转化效率和突变的高通量测序。经农杆菌介导法转化水稻愈伤,共获得约6000株水稻再生苗。水培法炼苗10天后,对再生苗喷洒高效氟吡甲禾灵(Haloxyfop)进行筛选,共发现四个除草剂抗性突变位点:P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外,其余三个抗性位点未曾在植物中有过报道。其中,P1927F与W2125C突变一样表现出强除草剂抗性,具有较高的生产应用潜能。基于同源蛋白结构模型分析发现,这些氨基酸突变直接或间接地影响了除草剂结合口袋的构象,从而降低了其对除草剂分子的结合能力而获得除草剂抗性。

      STEME技术体系的建立,对于原位(In situ)定向进化植物的内源功能基因提供了新型技术支撑,对农作物分子设计育种具有重要意义。此外,STEME系统还有望应用于不同细胞系、酵母或动物中的非编码区的顺式作用元件的调控、动物致病SNV的修正和抗药位点的筛选等。该研究成果于2020年1月13日在线发表于《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志(DOI:10.1038/s4-7)。高彩霞研究组博士生李超、助理研究员张瑞以及李家洋研究组副研究员孟祥兵为本文共同第一作者,研究员高彩霞和李家洋为共同通讯作者。遗传发育所陈宇航研究组和中科院微生物研究所邱金龙研究组参与了部分研究工作。该研究得到中科院战略性先导专项、国家自然基金委等的经费资助。

      遗传与变异是物种进化的基础。通过物理、化学方法(如辐射诱变、EMS诱变)产生全基因组的随机突变已经成为农作物育种的常规手段,但其中具有新型农艺性状突变体的筛选较为费时、费力。定向进化(Directed Evolution)则通过创制目标基因的突变文库,在施加一定选择压力下能够快速获得目的突变体。目前,植物基因的定向进化通常先通过易错PCR、DNA合成或DNA重组等方法在体外产生目标基因的突变文库,再转化到大肠杆菌或酵母中进行功能筛选。然而,由于离开原始的基因组和细胞环境,筛选出来的基因突变可能并不能完全反映出它在植物中的真实功能。更重要的是,大多数重要农艺性状无法在大肠杆菌或酵母中进行筛选。因此,建立一种在植物原位进行基因饱和突变和功能筛选的定向进化新方法将有助于加快植物育种及重要功能基因研究的进程。近日,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组和李家洋研究组合作,构建了新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器STEME,并在植物中实现了基因的定向进化和功能筛选。

      研究者将胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脱氨酶ecTadA-ecTadA7.10同时融合在nCas9 (D10A)的N端,并将抑制体内尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表达的形式置于nCas9 (D10A)的C端,共构建了4种形式的双碱基编辑器STEME(STEME-1至STEME-4)。STEME双碱基编辑器均可以只在一个sgRNA引导下就可以诱导靶位点CT和AG的同时突变,显著增加了靶基因碱基突变的饱和度及产生突变类型的多样性。STEME-1在水稻原生质体中CT诱导效率高达61.61%,CT和AG同时突变的效率也高达15.50%。为了提高靶基因的碱基覆盖度,研究者进一步利用能够识别NG PAM的变体Cas9-NG构建了第5个双碱基编辑器STEME-NG,发现只需要20个sgRNA就可以对OsACC上编码56个氨基酸的序列实现近饱和的突变。

      为了展示STEME在植物中的定向进化能力,研究者设计了靶向OsACC羧基转移酶结构域上400个氨基酸编码序列的200个独立的sgRNA,分别构建到STEME-1或STEME-NG双元载体上。将构建好的双元载体分为27个转化组,每个组内混合了等分子量的4至11个sgRNA载体,覆盖80-142 bp的靶DNA区域,便于提高转化效率和突变的高通量测序。经农杆菌介导法转化水稻愈伤,共获得约6000株水稻再生苗。水培法炼苗10天后,对再生苗喷洒高效氟吡甲禾灵(Haloxyfop)进行筛选,共发现四个除草剂抗性突变位点:P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外,其余三个抗性位点未曾在植物中有过报道。其中,P1927F与W2125C突变一样表现出强除草剂抗性,具有较高的生产应用潜能。基于同源蛋白结构模型分析发现,这些氨基酸突变直接或间接地影响了除草剂结合口袋的构象,从而降低了其对除草剂分子的结合能力而获得除草剂抗性。

      STEME技术体系的建立,对于原位(In situ)定向进化植物的内源功能基因提供了新型技术支撑,对农作物分子设计育种具有重要意义。此外,STEME系统还有望应用于不同细胞系、酵母或动物中的非编码区的顺式作用元件的调控、动物致病SNV的修正和抗药位点的筛选等。该研究成果于2020年1月13日在线发表于《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志(DOI:10.1038/s4-7)。高彩霞研究组博士生李超、90934a.com。助理研究员张瑞以及李家洋研究组副研究员孟祥兵为本文共同第一作者,研究员高彩霞和李家洋为共同通讯作者。遗传发育所陈宇航研究组和中科院微生物研究所邱金龙研究组参与了部分研究工作。该研究得到中科院战略性先导专项、国家自然基金委等的经费资助。

      图:(a) STEME介导的双碱基(CT和AG)编辑策略。(b) STEME-1介导的碱基编辑产物类型分布。(c) 利用STEME系统饱和突变OsACC CT结构域流程图。(d) STEME系统介导的OsACC氨基酸替换产生除草剂抗性。描写春天景色的诗句www.hj948.com...